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使用超濾離心管時所需要注意的事項
點擊次數:4272 更新時間:2021-01-20
  (1)選擇合適的超濾離心管。通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量為35kDa,就可以選擇10kDa截留分子量的產品。若目的蛋白分子量為10kD左右,則可以用截留分子量3kD的超濾管。認真閱讀使用說明書,注意超濾膜對各種化學物質的耐受程度有所不同。
  (2)新買來的超濾是干燥的,使用前加入超純水,水量*過膜,冰浴或冰箱里預冷幾分鐘。然后將水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超過管頂的白線為準。操作要輕,加入蛋白液前,需要插在冰上預冷。
  (3)平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快,否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾(離心機預冷至4度)。不同離心機的轉速rpm換算成g之后,有所不同。離心機的加速度調至低檔,減小對膜的壓力。注意,一定要等離心機達到目的轉速之后,方可離開離心機,否則離心機出問題時,無法馬上處理。膜與轉軸的方向根據說明書調整(角轉離心機的情況是膜與軸垂直)。在實際使用中,一般轉速開的比說明書里的要低,這樣可以延長離心管的使用壽命。
  (4)當濃縮到剩下1ml時,取50ul緩沖溶液,加入10ul流穿,看有沒變藍色,以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了,將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要準確判斷是否漏管,用5mgml的BSA離心10min,再取流穿,跑蛋白膠或Bradford粗測,繼續加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作,防止蛋白受熱),直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉淀,導致堵管。若發生沉淀,要確定沉淀的具體原因,是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾離心管同時超濾,降低濃度的辦法解決,后者的方法是換不同的緩沖溶液,直到蛋白不發生沉淀為止。
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